Introduzione ai fitoplasmi

  Diagnosi delle malattie da fitoplasmi


Una diagnosi generica delle malattie da fitoplasmi può essere fatta semplicemente attraverso l'osservazione dei sintomi: la presenza di fenomeni di virescenza, di fillodia o di scopazzi suggeriscono un’eziologia attribuibile a tali microrganismi. Resta poi l'opportunità di procedere agli esami al TEM per confermarne la loro presenza. Differenti fitoplasmi possono causare apparentemente sintomi identici in talune piante (es. flavescenza dorata e legno nero nella vite), così come fitoplasmi strutturalmente vicini ed anche ceppi diversi di uno stesso fitoplasma possono causare sintomi differenti su piante ospiti (Davis e Sinclair, 1998; Lee et al., 1998).

Questi fatti, ma anche la presenza di infezioni miste nella stessa pianta, amplificano ulteriormente la ricerca dell’effettivo agente causale o degli agenti causali.



I principali metodi diagnostici adottati attualmente per le malattie da fitoplasmi possono essere raggruppati come riportato di seguito:

Isolamento su piante test. I fitoplasmi possono essere trasmessi e conservati su piante test particolari, quali ad es. la pervinca (Catharanthus roseus G. Doni), che se infette manifestano giallumi o altri sintomi come virescenza, fillodia, scopazzi fiori piccoli, ecc..

Microscopia ottica a fluorescenza o metodo colorimetrico DAPI. I fitoplasmi non sono visibili al comune microscopio ottico a luce trasmessa. La colorazione DAPI (4 - 6 diamidino - 2 - fenilindolo) costituisce un mezzo rapido per individuare la presenza dei fitoplasmi nel floema delle piante. Il DAPI è un fluorocromo che si lega in modo aspecifico al DNA; osservando al microscopio ottico a fluorescenza le sottili sezioni di tessuti vegetali infetti trattate con DAPI è possibile rilevare all'interno dei tubi cribrosi aree fluorescenti in corrispondenza dei fitoplasmi (Seemüller, 1976).

Microscopia elettronica a trasmissione. In genere si osservano al TEM sezioni ultrasottili di piante infette, incluse in resina e poi contrastate con soluzioni di metalli pesanti. Attraverso quest'analisi si possono accertare la forma, la dimensione, la presenza-collocazione dei fitoplasmi nella pianta e le alterazioni cellulari indotte nell’ospite. Essendo microrganismi pleomorfici, la diagnosi al M.E. non può però essere specifica (Musetti et al., 1992). Questa limitazione può però essere superata con tecniche di immuno marcatura, utilizzando anticorpi specifici contro i diversi fitoplasmi (Musetti et al. 2002)

Test sierologici. Sono basati sulla combinazione altamente specifica esistente fra fitoplasma e anticorpi prodotti in animali immunizzati. Questi test sono veloci, affidabili e “massali”(si possono cioè applicare a molti campioni contemporaneamente) Finora si dispone però di un numero molto limitato di anticorpi (policlonali e monoclonali) contro i fitoplasmi. Per l'ottenimento di anticorpi monoclonali si prevede l'immunizzazione di topi di allevamento con il fitoplasma parzialmente purificato (Jang et al., 1989).

Una delle tecniche adottate in sierologia è l'ELISA ("Enzime-Linked-Immunosorbent- Assay"), che si basa su una colorazione sierologica ed enzimatica, operando in piastre appositamente predisposte, e l'immunofluorescenza (IF) nella quale si applica il monoclonale su sottili sezioni longitudinali di piccoli pezzi (ca. 1 cm) di fusto o di radice o di ramo o di picciolo fogliare, preventivamente fissati in glutaraldeide. A questo fine possono essere impiegate anche le sezioni predisposte per la colorazione DAPI, eseguendo nel contempo ambedue i saggi sullo stesso materiale.

Test molecolari. Le analisi delle sequenze del gene 16S rDNA - universale nei procarioti e che possiede regioni conservate e variabili che lo rendono utile per gli studi tassonomici - sono ampiamente usate per stabilire le relazioni filogenetiche fra microrganismi, compresi i Mollicutes. Negli anni '90, con l'avvento della tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR), quest'ultima è diventata una via preferenziale per la diagnosi dei fitoplasmi (Lee et al., 1998; Marzachì et al., 2002). Essa utilizza una DNA polimerasi batterica termostabile che permette di amplificare specificamente e selettivamente un tratto di DNA compreso fra due iniziatori di reazione ("primers") a sequenza nota. Al termine della reazione, l’amplificazione del tratto di DNA "bersaglio" renderà possibile la sua visualizzazione, dopo opportuna separazione elettroforetica (Davis et al., 1992; Firrao et al., 1993).

I “primers”maggiormente utilizzati per la diagnosi dei fitoplasmi possono essere suddivisi in due classi: universali ribosomiali e gruppo-specifici ribosomiali e non. La PCR eseguita con i primi fornisce l'indicazione della presenza di DNA fitoplasmico nel campione analizzato; il “primer”gruppo-specifico è un oligonucleotide con sequenza complementare ad un tratto di DNA presente soltanto in fitoplasmi appartenenti allo stesso gruppo tassonomico.

La diagnosi delle fitoplasmosi con i test molecolari viene effettuata secondo un procedimento che può essere suddiviso in tre fasi:

L’estrazione del DNA per la diagnosi dei fitoplasmi è fatta di norma dalle nervature principali delle foglie, nel tentativo di concentrare il tessuto vascolare e di conseguenza anche il floema all’interno del quale si trovano i fitoplasmi. Molto importante è anche l'epoca stagionale di campionamento e la scelta degli organi da prelevare.

L’amplificazione a catena della polimerasi (PCR) del DNA fitoplasmico avviene mediante denaturazione (apertura della doppia elica), attacco dei “primers”, riproduzione dei singoli filamenti e successiva riassociazione. Essa si ottiene ripetendo diverse volte opportuni cicli di temperature; in tal modo si consente di amplificare la regione del DNA compresa fra i due “primers”in modo esponenziale.

Nella “nested”-PCR, ad una PCR diretta con “primers”universali viene fatta seguire una PCR o con “primers”universali a cui segue l’analisi RFLP, o con “primers”gruppo-specifici

La funzione dei primers o sequenze d' innesco è quella di ibridarsi ad un tratto specifico di DNA con sequenza complementare ("target"), creando un tratto di DNA a doppia elica che sarà riconosciuto come substrato della successiva reazione di polimerizzazione. La scelta delle sequenze dei primers è una scelta chiave per garantire che la polimerasi amplifichi esclusivamente il DNA dell'agente patogeno, anche se presente in scarsa concentrazione. I primers specifici per la diagnosi dei fitoplasmi furono costruiti inizialmente sulla base di sequenze di tratti clonati di DNA ribosomiale e più recentemente sono stati ottenuti analizzando regioni del genoma con diverso grado di variabilità (es. la sequenza intergenica spaziatrice fra i geni codificanti il 16S ed il 23S rRNA o altre sequenze non ribosomiali).

L'analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) si fonda sulla considerazione che due sequenze di DNA altamente conservate ma non identiche possano presentare alcune differenze nucleotidiche che alterino il sito di riconoscimento specifico di almeno un enzima di restrizione. Essa viene realizzata mediante digestione dei prodotti dell’amplificazione PCR con enzimi che “tagliano”il DNA in corrispondenza di particolari sequenze nucleotidiche, frammentandolo in segmenti di varia lunghezza il cui profilo opportunamente rilevato caratterizza nel suo insieme il DNA originario. Il confronto dei diversi profili evidenzia il grado di omologia e quindi di affinità genetica tra i vari fitoplasmi, consentendo di distinguerli e classificarli.

Il risultato di analisi di confronto delle sequenze ribosomiali di fitoplasmi appartenenti allo stesso gruppo tassonomico ha permesso di evidenziare alcuni siti di restrizione la cui assenza, presenza o localizzazione sulla sequenza ribosomiale è caratteristica del gruppo o sottogruppo tassonomico di appartenenza. Dal punto di vista pratico, l'analisi RFLP prevede che il DNA amplificato venga digerito, in digestione singola, con un certo numero di enzimi di restrizione e che i frammenti della digestione vengano visualizzati con separazione elettroforetica e successiva colorazione con bromuro di etidio.

Sulla base dei dati disponibili, non pare che la classificazione basata sull’analisi RFLP del gene 16S rDNA rifletta sempre la completa serie delle diversità fenotipiche. Non sembra cioè che questo gene sia sufficientemente variabile da permettere la distinzione tra fitoplasmi che appartengono allo stesso gruppo 16Sr ma che differiscono per pianta ospite e/o per insetto vettore. Più variabili per esempio, sono le sequenze dei geni delle proteine ribosomiali, che hanno permesso l’identificazione di più gruppi RFLP di quanti ne fossero stati individuati esaminando il gene 16S rDNA, per quanto riguarda i ceppi di fitoplasmi appartenenti al gruppo del giallume dell’astro e dell’olmo (Lee et al., 2004 a; b)

Spesso nell’analisi filogenetica dei procarioti si utilizza la sequenza nucleotidica di tutto o quasi tutto il gene ribosomiale 16S rDNA. Il sequenziamento é tutt’oggi un servizio piuttosto costoso e la classificazione che deriva dall’analisi filogenetica corrisponde largamente ai raggruppamenti ottenuti con l’analisi RFLP del gene 16S rDNA amplificato mediante PCR.

Per questi motivi, le analisi RFLP delle sequenze del 16S rDNA (Lee et al., 1993) e di altri geni più variabili rappresentano un semplice e rapido metodo standard alternativo per la differenziazione e la classificazione di “routine”dei fitoplasmi non coltivabili su substrato artificiale. A questo scopo si utilizza un'ampia gamma di enzimi di restrizione e si comparano poi i profili (bande elettroforetiche) ottenuti con quelli dei ceppi-tipo dei fitoplasmi ceppi-tipo, designati per ciascun gruppo o sottogruppo.

Comune per i fitoplasmi sia la scissione o divisione diretta. La colonizzazione può avvenire sia nei tessuti delle piante che in quelli degli artropodi.

 
» I fitoplasmi e le fitoplasmosi delle piante
» Generalità sui fitoplasmi (ex micoplasmi)
» Classificazione dei fitoplasmi
» Sintomi indotti dai fitoplasmi
» Tramissione e diffusione dei fitoplasmi
» Diagnosi delle malattie da fitoplasmi
» Modalità di difesa